Fabrizio Loreni

CURRICULUM DI FABRIZIO LORENI

Dati anagrafici

Nato a

Roma, 20 ottobre 1959

Nazionalità

italiana

Stato civile

coniugato

Residenza

via Casilina 446, 00177 Roma

Posizione

professore associato nel Dipartimento di Biologia, Università "Tor Vergata" di Roma, settore BIO/11

Carriera

1978

Immatricolato al corso di laurea in Chimica dell'Università di Roma "La Sapienza".

1983-85

Lavora alla tesi sperimentale presso il Centro Acidi Nucleici del C.N.R. nel laboratorio del Prof. Francesco Amaldi, occupandosi dello studio della regolazione dell'espressione dei geni delle proteine ribosomali di Xenopus laevis.

1985

Consegue il diploma di laurea in Chimica con votazione 110/110 con lode discutendo la tesi "Sequenza nucleotidica e analisi strutturale del gene per la proteina ribosomale L1 in Xenopus laevis" relatori Prof. Francesco Amaldi e Prof. Alessandro Ballio.

1986-88

"Post-doctoral fellow" per due anni nel laboratorio della Prof.sa Diane Robins alla "Columbia University" di New York.

1989

Ricercatore di Biologia Molecolare (gruppo E05B) presso il Dipartimento di Biologia dell’ Università degli Studi di Roma "Tor Vergata"

1995-96

"Visiting scientist" per sei mesi nel laboratorio del Dr. George Thomas al Friedrich Miescher Institute a Basilea

2000-oggi

Professore Associato di Biologia Molecolare (settore BIO/11) presso il Dipartimento di Biologia dell’ Università degli Studi di Roma "Tor Vergata"

Titoli e borse di studio

1986

Borsa di studio per l'estero dell' "Istituto Pasteur - Fondazione Cenci-Bolognetti"  (presso il laboratorio della Prof.sa Diane Robins alla "Columbia University" di New York).

1987

Rinnovo della borsa di studio per l'estero dell' "Istituto Pasteur - Fondazione Cenci-Bolognetti"

1990

Socio della Societa Italiana di Biofisica e Biologia Molecolare

1995

Borsa di studio "EMBO - Short Term" per un periodo di tre mesi (presso il laboratorio del Dr. George Thomas al Friedrich Miescher Institute a Basilea)

1996

Borsa di studio "HSFPO - Short Term" per un periodo di tre mesi (presso il laboratorio del Dr. George Thomas al Friedrich Miescher Institute a Basilea)

Finanziamenti

1999-2001

TELETHON (E.818): Characterization of the genomic structure of the human SSADH gene £ 70 000 000

2000-2002

MURST-PRIN (MM06C81552_002): Sintesi di componenti ribosomali e funzionamento del ribosoma in colture primarie da pazienti con anemia Diamond-Blackfan e discheratosi  £ 60 000 000

2000

CNR Agenzia (CNRC00DFDE_004): Analisi dei meccanismi di regolazione traduzionale durante la mitosi £ 20 000 000

2001-2003

MIUR-FIRB 2001 (RBAU01Y44A_002): Patologia ribosomiale: il modello dell'anemia di Diamond-Blackfan. Analisi molecolare dei meccanismi patogenetici. € 31 000

2002-2004

TELETHON (GGP02434): Molecular Basis of Diamond-Blackfan Anemia. € 68 000

2003-2005

MIUR-PRIN 2003: Meccanismi molecolari, analisi genetica e fenotipi clinici delle distrofie miotoniche (coordinatore nazionale) € 40 000

2005-2007

MIUR-PRIN 2005 (2005068409_002 ): Regolazione della sintesi di componenti ribosomali. € 40 000

2007-2008

DBA Foundation Grant - Molecular alterations caused by RPS19 mutations and their role in DBA. €35 000

2007-2010

TELETHON (GGP07232): Molecular Basis of Diamond-Blackfan Anemia.  € 125 400

2007-2009

MIUR-PRIN 2007 (2007LJHMEJ): Crescita cellulare e funzione dell'apparato traduzionale (coordinatore nazionale) € 25 000

2010-2013

AIRC (IG 10653): PIM1 and ribosomal stress in prostate cancer cells € 135 000

2012-2015

MIUR-PRIN 2010-11: Ruolo dell'apparato traduzionale nel controllo della crescita cellulare e nella carcinogenesi (coordinatore nazionale) € 154 000

2013-2016

TELETHON (GGP13177): Rescue of Diamond-Blackfan Anemia haploinsufficiency by knock-up of the deficient protein

2013-2016

AIRC (IG 14756): Role of PIM1 and translation apparatus in prostate cancer cell growth € 165 000

Attività didattica

1986

Docente al corso "Ingegneria genetica applicata allo studio degli eucarioti", 15-23 settembre, Istituto di Fisiologia Generale, Università degli Studi di Roma "La Sapienza".

1990-93

Lezioni di Biologia Molecolare nel corso di laurea in Scienze Biologiche dell'Universita' di Roma "Tor Vergata".

1990-2001

Lezioni nel corso Laboratorio di Biologia Sperimentale nel corso di laurea in Scienze Biologiche dell'Universita' di Roma "Tor Vergata".

1992-95

Docente dell'insegnamento Complementi di Biologia e Genetica Molecolari nella Scuola di Specializzazione in Applicazioni Biotecnologiche dell'Università di Roma "Tor Vergata"

1993-2003

Docente dell'insegnamento Biologia Molecolare II (fondamentale d'indirizzo) nel corso di laurea in Scienze Biologiche dell'Università di Roma "Tor Vergata".

1995-2001

Docente dell'insegnamento "Tecniche per la determinazione di sequenza di acidi nucleici" nella Scuola di Specializzazione in Applicazioni Biotecnologiche dell'Università di Roma "Tor Vergata"

2000-oggi

Relatore di tesi di Laurea Quinquennale, Triennale, e Specialistica nei vari corsi di Laurea associati al Dipartimento di Biologia dell’Università Tor Vergata

2000-oggi

Docente della Scuola di Dottorato in Biologia Cellulare e Molecolare dell'Università di Roma "Tor Vergata" e Docente guida per lo svolgimento delle tesi di dottorato

2001-2010

Docente dell'insegnamento Metodologie di Biochimica e Biologia Molecolare (2 CFU) nel corso di Laurea Triennale Biologia Cellulare e Molecolare dell'Università di Roma "Tor Vergata"

2002-2009

Docente dell'insegnamento Biologia Molecolare (5 CFU) nel corso di Laurea Triennale  in Biotecnologie dell'Università di Roma "Tor Vergata"

2002-2006

Docente dell'insegnamento Laboratorio Integrato II anno (2 CFU) nel corso di Laurea Triennale in Biotecnologie dell'Università di Roma "Tor Vergata"

2003-2009

Docente dell'insegnamento Espressione Genica (4 CFU) nel corso di Laurea Specialistica in Biologia Cellulare e Molecolare dell'Università di Roma "Tor Vergata".

2009-2011

Docente dell'insegnamento Regolazione Genica (4 CFU) nel corso di Laurea Magistrale in Biologia Cellulare e Molecolare dell'Università di Roma "Tor Vergata"

2009-oggi

Docente dell'insegnamento Biologia Molecolare (6 CFU) nel corso di Laurea Triennale  in Biotecnologie dell'Università di Roma "Tor Vergata"

2011-oggi

Docente dell'insegnamento Espressione Genica (6 CFU) nel corso di Laurea Magistrale in Biologia Cellulare e Molecolare dell'Università di Roma "Tor Vergata"

Seminari e presentazioni orali a congressi

1995

Translational regulation of ribosomal protein synthesis in vertebrates. Nel corso "Translational control" del Biozentrum, University of Basel. 22 giugno, Basel (Svizzera).

1997

Regulation of 5' TOP mRNA translation. Nel corso "Translational control" del Biozentrum, University of Basel. 19 giugno, Basel (Svizzera).

1999

RNA/protein interaction in the control of ribosomal protein synthesis. Nella conferenza "New insights into the mechanism of mRNA translation". 22-26 marzo, Assois (Francia).

Regulation of 5' TOP mRNA translation. Nel corso "Translational control" del Biozentrum, University of Basel. 1 luglio, Basel (Svizzera)

Evoluzione del gene: dall'RNA al DNA. Nel corso "Biofisica del DNA". Scuola Nazionale di Biofisica 1999, Bressanone 13-15 settembre.

Regolazione della traduzione dipendente dalle condizioni di crescita cellulare: gli mRNA TOP. Centro Genetica Evoluzionistica C.N.R, Roma 13 dicembre.

2000

Sintesi del ribosoma e patologia ribosomiale. Dipartimento di Scienze Mediche, Università del Piemonte Orientale, Novara 6 novembre 2000.

2001

Cis- and trans-acting elements in the translational control of 5' terminal oligopyrimidine mRNAs. Nella conferenza "2001: Translation UK", University of Sussex, Brighton, UK 3-4 settembre

2002

Serum and amino acid deprivations have an additive effect on TOP mRNA translational control. Nella conferenza "2002 Translation, the IX UK protein synthesis meeting".  Manchester 4-5 luglio

2003

Regolazione traduzionale dell'espressione genica: micro RNA e sintesi dei ribosomi.Dipartimento di Scienze Mediche, Università del Piemonte Orientale, Novara 18 giugno.

2005

Growth signaling to the translational apparatus: regulation of TOP mRNAs. Department of Molecular Medicine and Biotechnology, School of Medicine University of Rijeka, Rijeka, Croatia, 30 maggio.

2006

Alterations of RPS19 function caused by DBA mutations.The 7th Diamond Blackfan Anemia International Consensus conference. New York N. Y. March 11-13.

Translational regulation in the synthesis of the tranlational apparatus. FISV-VIII Annual Meeting, Riva del Garda, 28 Sept.-1 Oct

2007

Missense mutations in RPS19 affect protein stability, nucleolar localization and ribosome assembly. The 8th Diamond Blackfan Anemia International Consensus conference. New York N. Y. March 17-19.

2008

Role of the rps19-pim1 interaction in the regulation of cell metabolism. The 9th Diamond Blackfan Anemia International Consensus conference. New York N. Y. March 11-13.

2009

PIM1 kinase plays a role in the response to ribosomal stress of dba cells. The 10th Diamond Blackfan Anemia International Consensus conference. New York N. Y. March 14-16.

PIM1 oncoprotein is destabilized by ribosomal stress and inhibits cell cycle progression. 8th International Conference on Ribosome Synthesis. Regensburg, Germany, August 26-30

2010

Regulatory mechanisms in the synthesis of ribosomal components in response to ribosomal stress.The 11th Diamond Blackfan Anemia International Consensus conference. New York N. Y. March 13-15.

PIM1 oncoprotein is destabilized by ribosomal stress and inhibits cell cycle progression. Protein Translation and Cancer. Coronado, CA. February 3-6.

2012

Analysis of the signaling pathways activated in response to ribosomal stress. The 12th Diamond Blackfan Anemia International Consensus conference. New York N. Y. March 17-19.

2012

Ribosomal stress and ribosomopathies.mRNA Fate Workshop. Riva del Garda, May 23-26.

2013

Molecular mechanisms of ribosomophaties. Department of Biology and Biotechnology "Charles Darwin", University La Sapienza, Roma. June 26

2014

Ribosome alteration in cancer: effect or cause? University Eastern Pedemont, Novara, June 11

2014

Role of the translation apparatus in cell growth and migration.The 2nd International Symposium on Burn Rehabilitation and Wound Healing (ISBRWH).  Chongqing, China   October 8-11

2016

Analysis of the molecular mechanism of DBA in cultured cells from patients. The 14th Diamond Blackfan Anemia International Consensus conference. Atlanta GA. March 17-19.

Presentazioni a congressi (poster)

1989-oggi

Ha presentato lavori in numerose edizioni dei seguenti congressi internazionali:

"Translational control", Cold Spring Harbor, New York, USA (ogni due anni)

"International Conference on Ribosome Synthesis" (ogni tre anni localita' variabile)

"EMBO Conference on Protein Synthesis and Translational Control" Heidelberg (ogni due anni)

"Translation UK" (annuale, localita' variabile)

"Diamond Blackfan Anemia International Consensus conference". New York, USA (annuale)

Ha presentato lavori in numerosi altri congressi internazionali

Ha presentato lavori in numerose edizioni dei seguenti congressi nazionali:

Convegno SIBBM

Seminario SIBBM

Convegno FISV

Collaborazioni relative a pubblicazioni (indicati i group leader)

1994

Oded Meyuhas,The Hebrew University-Hadassah Medical School, Jerusalem, Israel

2000

George Thomas,Department of Growth Control, Friedrich Miescher Institut, Basel, Switzerland

2004

Christopher Proud, University of Dundee, United Kingdom;

Gil Tchernia, Faculte´ de Medecine Paris-sud, Hopital Bicetre, France;

Irma Dianzani, Università del Piemonte Orientale, Novara

Irene Bozzoni, Università La Sapienza, Roma

2005

Stefano Biffo, Istituto San Raffaele, Milano

Irma Dianzani, Università del Piemonte Orientale, Novara

Niklas Dahl, Uppsala University, Sweden

2006

Giuseppe Novelli, Università Tor Vergata, Roma

Alessandro Quattrone, Università di Firenze

2007

Irma Dianzani, Università del Piemonte Orientale, Novara

2008

Claudio Sette, Università Tor Vergata, Roma

Irma Dianzani, Università del Piemonte Orientale, Novara

2009

Ugo Ramenghi, Università di Torino, Torino

2010

Irma Dianzani, Università del Piemonte Orientale, Novara

Giuseppe Novelli, Università Tor Vergata, Roma

2011

Stefano Biffo, Istituto San Raffaele, Milano

2012

Marina Romero-Ramos,  Aarhus University, Denmark

2013

Margherita Ruoppolo,  Fondazione SDN-IRCCS, Napoli

Dawn E. Watkins-Chow, National Institutes of Health, USA

Stefano Biffo, Istituto San Raffaele, Milano

Dati bibliografici

1985-2016

Autore o co-autore di 60 pubblicazioni "peer reviewed"

Citazioni totali: 1419 (WoS)

H-index: 24 (WoS)

ORCID ID 0000-0003-0323-3072

Attività editoriale

2014-oggi

Membro del Comitato Editoriale della rivista World Journal of Biochemistry

2016

Membro del Comitato Editoriale della rivista Frontiers in Genetics

2016

Membro del Comitato Editoriale della rivista Frontiers in Molecular Biosciences

Attività di divulgazione

1999

Enciclopedia Medica Italiana, voce " Genetica, fattori di trascrizione". Agg. II, Tomo II, pp 2395-2405. USES – Firenze

2007

Revisione del libro di testo "Weaver, Biologia Molecolare, Mcgraw-Hill"

2014-oggi

Membro del comitato scientifico e dei referee della rivista "Scienze e Ricerche"

Attività di valutazione (Peer-review)

2000-oggi

Valutazione (referee) di pubblicazioni per le riviste: EMBO journal, Nucleic Acids Research, Human Mutation, Cell Death and Differentiation, FEBS letters, Gene, British Journal of Haematology, Wires RNA, Neuroscience

2005

Valutazione di 9 prodotti per il CIVR - Comitato di Indirizzo per la Valutazione della Ricerca

2009

Valutazione di progetti PRIN 2008

2011

Valutazione di richiesta di finanziamento a "Agence Nationale de la Recherche" (ANR), Francia

Valutazione di richiesta di finanziamento a "Diamond Blackfan Anemia Foundation", USA

Valutazione di richiesta di finanziamento per "Foundation for Scientific Research" Belgio

Valutazione di un candidato a "Professorship step VI" nel Department of Molecular, Cell and Developmental Biology, University of California, Los Angeles

2012

Valutazione di richiesta di finanziamento a "University of Leuven" Belgio

2013

Valutazione di progetti PRIN 2012

Organizzazione congressi

2006

8° Convegno FISV. Simposio "Synthesis and regulation of the translational apparatus in eukaryotes". Riva del Garda 28 settembre-1ottobre

2009

11° convegno FISV. Simposio "Regulation of protein synthesis in health and disease". Riva del Garda 23-25 settembre.

Attività scientifica

1983-85

Sequenziamento del gene per la proteina ribosomale L1 di Xenopus

Durante il periodo di lavorazione alla tesi sperimentale nel laboratorio del Prof. Amaldi, dove si studia la regolazione dell'espressione dei geni per le proteine ribosomali in Xenopus laevis, è stato affrontato prevalentemente l'aspetto strutturale. Utilizzando le tecniche di clonaggio fondamentali è stata determinata la sequenza nucleotidica completa del gene per la proteina ribosomale L1, precedentemente isolato e delle due copie di mRNA presenti nello Xenopus laevis, che erano state isolate (come cloni di cDNA) e caratterizzate. Utilizzando i dati di sequenza nucleotidica raccolti sono state messe in evidenza, mediante l'uso di programmi specifici al computer, delle regioni che, per le loro caratteristiche di ripetizione (anche in una specie diversa di Xenopus) e di complementarità, potrebbero avere un ruolo nella regolazione dell'espressione del gene.

1986-88

Regolazione dell'espressione genica da parte degli ormoni steroidei

Allo scopo di approfondire lo studio dei meccanismi della regolazione dell'espressione dei geni negli organismi eucariotici, è iniziato, nel febbraio '86, il lavoro nel laboratorio della Prof.sa Diane Robins alla "Columbia University" di New York. In questo laboratorio, dove si studiava la regolazione dell'espressione dei geni da parte degli ormoni steroidei, è stato portato avanti un progetto sulla regolazione del gene Slp (Sex limited protein) di topo da parte degli ormoni androgeni. Il gene Slp di topo pur essendo altamente omologo all'adiacente gene C4 (componente del complemento) presenta, differentemente da quest'ultimo, una regolazione dell'espressione mediata dal testosterone. Il progetto si proponeva di caratterizzare, attraverso esperimenti di trasfezione in linee cellulari di costruzioni geniche, gli elementi responsabili di tale regolazione. Il lavoro svolto nei due anni di permanenza nel laboratorio ha permesso l'identificazione, nella regione a monte del gene Slp, di un elemento "enhancer" dipendente dal testosterone responsabile dell'attivazione trascrizionale del gene da parte dell'ormone.

1989-92

Regolazione dell'espressione dei geni per le proteine ribosomali

Nel febbraio '89 è iniziato ufficialmente il lavoro come ricercatore nel laboratorio del Prof. Amaldi nell'Università "Tor Vergata" di Roma. Riallacciandosi in parte al lavoro compiuto durante la tesi di laurea e' stato proseguito lo studio della regolazione dell'espressione dei geni negli eucarioti, ed in particolare della regolazione traduzionale della sintesi delle proteine ribosomali in Xenopus laevis. Utilizzando un sistema di selezione differenziale di una banca di cDNA sono stati isolati cloni corrispondenti a sette nuove proteine ribosomali. Il metodo di selezione era stato ideato con lo scopo di isolare cDNA di proteine controllate traduzionalmente durante l'embriogenesi di Xenopus. Dopo aver ottenuto dati di sequenza nucleotidica i cloni sono stati identificati tramite ricerca di omologia su banche dati mediante computer.

Per quanto riguarda la regolazione della trascrizione e' stato portato avanti un lavoro in collaborazione con il Centro Acidi Nucleici del C.N.R. contribuendo con esperimenti di trasfezione di costruzioni geniche in cellule HeLa, alla caratterizzazione del controllo trascrizionale del gene L14 di Xenopus  e della conservazione evolutiva di tale controllo.

1992-94

Controllo traduzionale degli mRNA per le proteine ribosomali

Utilizzando le tecniche acquisite nei due anni di permanenza alla "Columbia University" è iniziato un progetto sul controllo traduzionale in colture cellulari. Lavorando sulla linea cellulare di Xenopus B 3.2 sono state messe a punto condizioni che evidenziano la variazione di utilizzazione degli mRNA per le proteine ribosomali da parte delle cellule in diverse condizioni di crescita. In tale sistema sperimentale si è potuto seguire la cinetica del cambiamento di localizzazione degli mRNA per le proteine ribosomali (da polisomi a mRNP e viceversa). I risultati hanno dimostrato che tale cambiamento e' molto rapido, reversibile e che avviene senza modificazione della stabilita' degli mRNA.

In collaborazione con il Dr. O. Meyuhas dell'Universita' di Gerusalemme è stata approfondita la caratterizzazione del controllo traduzionale degli mRNA per le proteine ribosomali nei vertebrati. In particolare e' stata dimostrata la conservazione dei meccanismi di regolazione tra anfibi e mammiferi. Infatti un gene di proteina ribosomale di topo (rpL32) introdotto in cellule di Xenopus e' soggetto alla regolazione traduzionale come un gene di proteina ribosomale endogeno e viceversa.

1995-96

Analisi in vitro del controllo traduzionale

Lavori in diversi laboratori hanno dimostrato che gli elementi cis-agenti necessari al controllo traduzionale degli mRNA per le proteine ribosomali sono localizzati nella regione al 5' non tradotta (5' UTR) ed in particolare nel tratto di pirimidine presente all'estremita' 5' di tutti gli rp-mRNA dei vertebrati. Per quanto riguarda gli elementi trans-agenti, dati della letteratura suggeriscono il coinvolgimento della proteina ribosomale S6 che cambia stato di fosforilazione in relazione alla crescita cellulare. Allo scopo di verificare il ruolo della rpS6 nel controllo traduzionale è iniziato un progetto sulla messa a punto di un sistema di traduzione in vitro . Il progetto per il quale sono state ottenuto due borse di studio, prima EMBO e poi HSFPO, è stato svolto nel laboratorio del Dr. Gerorge Thomas al Friedrich Miescher Institute di Basilea, nel quale la fosforilazione della rpS6 è studiata da diversi anni. Il sistema messo a punto è costituito da estratti di cellule HeLa in diverse condizioni di crescita. Infatti le cellule HeLa, come altre linee cellulari di vertebrati, possono essere indotte in due diversi stati di crescita aggiungendo e togliendo siero dal terreno di coltura: 1) crescita rapida (cellule stimolate con siero), con gli rp-mRNA attivamente tradotti e localizzati sui polisomi; 2) quiescenza (cellule private del siero), con gli rp-mRNA traduzionalmente repressi localizzati nelle mRNP. Gli estratti di traduzione preparati dalle cellule nelle diverse condizioni conservano, per periodi d'incubazione di 10-15 minuti, il comportamento traduzionale delle cellule. Infatti in seguito all'aggiunta di mRNA totale agli estratti, si osserva che gli rp-mRNA sono caricati sui polisomi solo nell'estratto preparato da cellule stimolate mentre dei controlli come l'mRNA per l'actina lo sono in entrambi gli estratti. A questo punto l'aggiunta di molecole specifiche agli estratti (proteine, anticorpi ecc.) permetterà la caratterizzazione degli elementi coinvolti nel controllo traduzionale.

1997-2000

Studio dei fattori trans-agenti coinvolti nel controllo traduzionale dei geni per le proteine ribosomali (geni TOP).

Allo scopo di evidenziare fattori trans-agenti responsabili del controllo traduzionale dei geni TOP, nel laboratorio della dott.ssa Pierandrei-Amaldi del CNR erano state identificate due proteine in grado di legare in vitro il 5’ UTR degli mRNA TOP: la proteina La, e la proteina CNBP (Cellulare Nucleic acid Binding Protein). I risultati ottenuti dimostravano che entrambi questi fattori potevano avere un ruolo nel controllo traduzionale. In particolare la proteina La aveva un effetto positivo sulla traduzione degli mRNA TOP mentre la proteina CNBP era un repressore. Tuttavia poiché tali studi si basavano esclusivamente su esperimenti in vitro mancava l’evidenza che tali fattori avessero un ruolo in vivo nel controllo traduzionale. Per ottenere tali evidenze nel nostro laboratorio sono stati portati avanti esperimenti di trasfezione stabile in cellule in coltura di Xenopus nei quali il cDNA codificante per la proteina La e dei mutanti per delezione di esso, vennero espressi in maniera inducibile. I risultati hanno dimostrato che la sovraespressione di La completo ma non dei suoi mutanti ha un ruolo posito sulla traduzione degli mRNA TOP (A20).

Inoltre allo scopo di comprendere il ruolo di CNBP e di approfondire la funzione di La nel controllo traduzionale abbiamo preparato dei costrutti chimerici contenenti il promotore e il 5' UTR di vari geni TOP e la sequenza codificante della Green Flurescence Protein. Mutazioni nei siti di legame di La e CNBP verranno introdotte nei costrutti che saranno poi usati come reporter nell'analisi della funzione di La e CNBP. Analisi preliminari hanno mostrato che costrutti contenenti almeno un introne nella porzione 5' sono tradotti più efficientemente. Per questa ragione introni di diversa origine verranno introdotti nei costrutti. I plasmidi "reporter" verranno usati in esperimenti di cotrasfezione insieme a costrutti codificanti per La e CNBP in modo da valutare l'effetto di mutazioni nelle due proteine sul controllo traduzionale.

2000-2003

Trasduzione del segnale nella regolazione traduzionale degli mRNA TOP.

Numerose evidenze indicano un coinvolgimento della via di trasduzione del segnale di S6K1 e mTOR nella regolazione traduzionale dei messaggeri TOP indotta da mitogeni. Più recentemente il pathway mTOR/S6K sembra essere coinvolto anche nella risposta alla presenza di aminoacidi ma il suo ruolo nella regolazione degli mRNA TOP non è ancora ben definito. Abbiamo analizzato la relazione esistente tra la regolazione traduzionale degli mRNA TOP indotta da mancanza di siero e quella indotta da mancanza di amminoacidi. Utilizzando cellule HeLa come sistema sperimentale, abbiamo osservato l'effetto del siero e/o degli amminoacidi sull'associazione ai polisomi di messaggeri TOP e non-TOP. I nostri risultati indicano che l'assenza di siero e amminoacidi hanno un effetto additivo sull'inibizione traduzionale degli mRNA TOP. La risposta alla mancanza di amminoacidi è più forte e influenza, sebbene in modo variabile, anche i messaggeri non-TOP. Inoltre, la stimolazione da amminoacidi sembra agire attraverso un via rapamicina-sensibile simile alla stimolazione indotta dal siero, ma anche attraverso una via aggiuntiva rapamicina-resistente wortmannina sensibile. Questa via interessa anche gli mRNA non-TOP e probabilmente coinvolge la fosforilazione della subunità alfa del fattore eIF2.

2000-oggi

Regolazione della sintesi di componenti ribosomali nell'anemia di Diamond-Blackfan.

La DBA è un'eritroblastopenia caratterizzata da precursori eritroidi diminuiti o assenti. Circa il 30% dei bambini affetti presenta una varietà di anomalie fisiche associate, tra cui malformazioni craniofacciali, del pollice, cardiache e dell'apparato urogenitale. In seguito alla scoperta del coinvolgimento della proteina ribosomale (RP)S19, l'analisi di 190 pazienti di DBA ha evidenziato alterazioni nella sequenza di RPS19 comprendenti nonsenso, missenso, splicing, frameshift e perdita di un allele, in circa il 24% dei casi. Le mutazioni di RPS19 nella DBA rappresentano il primo caso di alterazione in una RP nei vertebrati. Studi precedenti sulla malattia hanno analizzato il tipo di mutazioni nel gene e alcuni aspetti del metabolismo dei tessuti interessati, mentre l'analisi dell'espressione di RPS19 e delle altre componenti ribosomali nelle cellule dei malati di DBA non è stata ancora riportata. Allo scopo di analizzare le alterazioni molecolari causate dalle mutazioni, abbiamo utilizzato diverse linee cellulari, linfoblasti immortalizzati con EBV e fibroblasti, di pazienti DBA che presentano o meno la mutazione nel gene RPS19. L’analisi del livello dell’mRNA di RPS19 ha evidenziato: 1) una diminuzione fino al 50% di tale messaggero nelle linee linfoblastoidi mutate in RPS19, 2)nessuna variazione nel livello dell’mRNA RPS19 nelle linee fibroblastoidi senza mutazione e nelle linee di fibroblasti a nostra disposizione che presentano però solamente mutazioni missense. Nelle linee linfoblastoidi mutate la diminuzione del messaggero di RPS19 è probabilmente dovuta all’effetto del Non-sense Mediated Decay (NMD) e del Non-Stop Decay. Tali meccanismi degradano rispettivamente messaggeri che presentano codoni di Stop prematuri (PTC) o mancanti di tale segnale, attraverso una via dipendente dalla traduzione. Gli mRNA RPS19 delle linee mutate presentano queste caratteristiche, quindi al fine di verificare tale ipotesi, abbiamo trattato le linee cellulari con inibitori della traduzione e analizzato l’RNA estratto attraverso RT-PCR e Northern. Gli esperimenti mostrano un aumento del messaggero RPS19 nelle linee trattate, dimostrando che la degradazione dipende dalla traduzione.

2003-2006

Analisi molecolare della distrofia miotonica: ruolo di ZNF9 nella DM2

La distrofia miotonica è una malattia autosomica dominante che colpisce, oltre al muscolo scheletrico, molti altri tessuti inclusi gli occhi, il cuore, lo stomaco, il sistema endocrino e il sistema nervoso centrale e periferico. Nel 1992 è stato osservata una espansione instabile di trinucleotidi ripetuti sul cromosoma 19 nella maggior parte dei casi di DM diagnosticati. L’espansione è localizzata nella regione 3’UTR del gene DMPK e nella regione del promotore del gene omeoticoadiacente SIX5. Rimane ancora da chiarire come l’espansione CTG in una regione non codificante di un gene possa causare il complesso fenotipo DM. Più recentemente è stata identificata da Ranum e collaboratori la causa genetica di una seconda forma di DM. La mutazione nella DM2 consiste nell’espansione di una ripetizione tetranucleotidica (CCTG) nel primo introne del gene CNBP/ZNF9. In collaborazione con diversi centri di ricerca italiani abbiamo ottenuto biopsie muscolari e campioni di sangue da pazienti DM2. Il sangue è stato poi utilizzato per ottenere linee linfoblastoidi immortalizzate con EBV. Sia i tessuti che le colture cellulari sono state utilizzati in esperimenti di Western blot con antisieri contro ZNF9 e actina come controllo. Inoltre in parallelo sono stati analizzati anche vari tessuti di ratto. I risultati preliminari indicano che: 1) ZNF9 è espresso in tutti i tessuti analizzati; 2) il livello di ZNF9 nei tessuti e nelle linee DM2 è più basso che nei controlli.

2004-2010

Ruolo della chinasi PIM1 nella risposta allo "stress ribosomale".

Nel corso di una ricerca di interattori della RPS19 in collaborazione con la prof.ssa Irma Dianzani dell'Universita' del Piemonte Orientale, abbiamo identificato la proteina PIM1. Questa protein chinasi, in grado di fosforilare residui di serina e treonina, e' espressa ad alti livelli in cellule dei tessuti ematopoietici e in collaborazione con Myc puo' indurre tumori. Allo scopo di studiare il rapporto tra PIM1 e la funzione e regolazione del ribosoma, abbiamo preparato una linea cellulare trasfettata stabilmente inducibile per la sovraespressione di PIM1. Abbiamo analizzato i parametri di crescita cellulare in seguito ad induziione dell'espressione di PIM1 ed abbiamo osservato sia aumento della proliferazione che dell'attivita' di sintesi proteica. Inoltre gli effetti osservati sembrano insensibili alla rapamicina, indicando che gli efetti di PIM1 probabilmente non dipendono da mTOR. L'analisi quantitativa dell'interazione PIM1-ribosomi indica che solo una parte dei ribosomi coinvolti nella sintesi proteica interagice con PIM1 (circa 10-20%). La percentuale di ribosomi che interagisce con PIM1 sembra inoltre veriare nelle diverse condizioni di crescita della cellula e nelle diverse linee cellulari analizzate. Sempre allo scopo di studiare il rapporto PIM1-ribosoma abbiamo analizzato una linea cellulare inducibile per RNA interference contro la RPS19. Abbiamo osservato che la diminuzione della sintesi di RPS19 e' correlata ad una confrontabile diminuzione di PIM1. La diminuzione di PIM1 sembra dovuto a destabilizzazine della proteina. Quindi PIM1 potrebbe essere coinvolto nella risposta della cellula a difetti nella sintesi e/o funzione del ribosoma.

2010-oggi

Ruolo della chinasi PIM1 nella regolazione della sintesi proteica in cellule in coltura di carcinoma prostatico

Uno dei meccanismi messi in atto dalle cellule tumorali per promuovere la trasformazione neoplastica è la deregolazione della traduzione. La stimolazione costitutiva del complesso mTORC1, regolatore chiave della sintesi proteica, è una alterazione di questo tipo riscontrata spesso nel cancro alla prostata.

Recentemente, nel laboratorio dove ho svolto la tesi, è stato scoperto che la chinasi Pim1 è in grado di interagire stabilmente con il ribosoma attraverso l’associazione con la proteina ribosomale S19 (RPS19). Inoltre, dati di letteratura indicano tra i substrati della chinasi Pim1 regolatori della traduzione quali 4EBP1 e AKT, condivisi con la chinasi mTOR. Questi dati e l’evidenza che in molti tipi di cancro si osservano elevati livelli di espressione della proteina Pim1, hanno suggerito una correlazione tra Pim1 e la regolazione della traduzione.

Partendo da queste evidenze, vogliamo chiarire il ruolo della chinasi Pim1 nel controllo della traduzione in cellule di cancro alla prostata PC3.